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★ 一株海南坡鹿源化膿隱秘桿菌的分離鑒定及生物學(xué)特性分析

薩家祺，曾繁文，翟俊瓊，黃  康，陳絢姣，王國(guó)蒨，陳興永*，張馬龍*

（廣州動(dòng)物園，廣州市野生動(dòng)物研究中心，廣州，510075）

論文摘要

為確定廣東省某動(dòng)物園1只患病海南坡鹿（Rucervus eldii hainanus）的致病菌并探究其主要生物學(xué)特性，采集患病坡鹿膿汁，通過(guò)細(xì)菌分離純化、形態(tài)學(xué)觀察、16S rRNA基因測(cè)序分析和生化試驗(yàn)鑒定對(duì)分離株進(jìn)行種屬鑒定；通過(guò)藥敏試驗(yàn)和毒力基因檢測(cè)對(duì)分離菌進(jìn)行生物學(xué)特性分析。結(jié)果顯示：該菌株菌落形態(tài)呈微弱β溶血、光滑濕潤(rùn)、乳白色、中間凸起且邊緣整齊；革蘭氏染色呈圓形革蘭氏陽(yáng)性短桿狀菌。16S rRNA基因測(cè)序分析顯示，該菌與10株化膿隱秘桿菌（Trueperella pyogenes）參考菌株同源性在98.81%以上；生化試驗(yàn)鑒定顯示，分離菌對(duì)蔗糖、麥芽糖和葡萄糖等呈陽(yáng)性，對(duì)乳糖、鼠李糖和甘露醇等呈陰性。綜合以上結(jié)果確定該分離株為化膿隱秘桿菌。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，該菌對(duì)青霉素、頭孢曲松、頭孢克肟等抗菌藥物耐藥。毒力基因檢測(cè)結(jié)果顯示，分離株攜帶Plo-g2、Plo-g1、NanP、NanH、FimA、FimE、FimC 七種毒力基因。研究結(jié)果可為野生動(dòng)物源化膿隱秘桿菌的防治提供參考依據(jù)，為化膿隱秘桿菌的進(jìn)一步研究提供素材。

論文速覽

化膿隱秘桿菌（Trueperella pyogenes，TP）又稱化膿放線菌，屬于放線菌科（Actinomycetaceae）隱秘桿菌屬（Trueperella）成員，是一種兼性厭氧的革蘭氏陽(yáng)性桿菌。1893年，該菌首次在牛的膿汁中被發(fā)現(xiàn)，可引發(fā)肺炎、肝膿腫、乳房炎等化膿性病變，嚴(yán)重者會(huì)引發(fā)毒血癥或敗血癥導(dǎo)致個(gè)體死亡，對(duì)動(dòng)物健康造成嚴(yán)重威脅。目前，該菌在多種動(dòng)物體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)，多見(jiàn)于豬、牛、羊等家畜，長(zhǎng)期以來(lái)對(duì)養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展造成巨大經(jīng)濟(jì)損失并威脅人的安全。

海南坡鹿（Rucervus eldii hainanus）是國(guó)家一級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物，屬于哺乳綱（Mammalia）鯨偶蹄目（Cetartiodactyla）鹿科（Cervidae），是坡鹿的亞種之一，被IUCN評(píng)估為瀕危（EN）物種，當(dāng)前對(duì)于海南坡鹿的研究主要集中在種群遺傳、行為習(xí)性、生境選擇和營(yíng)養(yǎng)等，對(duì)于細(xì)菌感染的診治和預(yù)防方面的研究報(bào)道相對(duì)較少。本研究采集海南坡鹿臉頰部膿液，通過(guò)細(xì)菌分離純化和16S rRNA基因測(cè)序，成功分離并鑒定出1株化膿隱秘桿菌，并對(duì)其主要的生物學(xué)特性進(jìn)行研究，以期為今后化膿隱秘桿菌在野生動(dòng)物的防控與治療提供參考依據(jù)。

● 海南坡鹿（曾繁文 攝影）

廣東省某動(dòng)物園1只患病海南坡鹿，患病前期表現(xiàn)出精神沉郁，食欲廢絕，呼吸急迫，中期發(fā)現(xiàn)臉頰部隆起，麻醉后切開(kāi)有膿汁流出，經(jīng)過(guò)2周藥物治療患病動(dòng)物有好轉(zhuǎn)。用無(wú)菌拭子在無(wú)菌操作下采集膿腫處膿汁后用保溫箱低溫送至實(shí)驗(yàn)室。將樣品采取三線法接種到血瓊脂平板之后挑取單菌落經(jīng)革蘭氏染色觀察、16S rRNA基因鑒定、生化試驗(yàn)鑒定、藥敏試驗(yàn)分析和毒力基因檢測(cè)等分析分離菌的生物學(xué)特性。

研究結(jié)果顯示分離菌可見(jiàn)微弱β溶血、光滑濕潤(rùn)、呈乳白色、中間凸起、邊緣整齊的圓形菌落；鏡檢可見(jiàn)無(wú)莢膜、無(wú)芽孢，單個(gè)或聚集存在的兩端鈍圓短桿狀菌體；對(duì)分離菌16S rRNA擴(kuò)增后進(jìn)行BLAST比對(duì)分析顯示化膿隱秘桿菌參考菌株基因序列同源性在98.81%以上；生化鑒定發(fā)現(xiàn)分離菌對(duì)蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、木糖、果糖呈陽(yáng)性，對(duì)乳糖、鼠李糖、甘露醇、山梨醇、吲哚、接觸酶和硝酸鹽呈陰性；且對(duì)多種抗菌藥物顯示產(chǎn)生耐藥性，以及含有Plo-g2、Plo-g1、NanP、NanH、FimA、FimE、FimC七種毒力基因。

● 分離菌的菌落形態(tài)（A）與革蘭氏染色鏡檢結(jié)果（B）

● 分離菌16S rRNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物序列比對(duì)結(jié)果

● 分離菌生化試驗(yàn)鑒定結(jié)果

● 分離菌耐藥性結(jié)果

● 分離菌毒力基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果

目前，化膿隱秘桿菌尚無(wú)有效疫苗，主要是通過(guò)抗菌藥物治療，但抗菌藥物的濫用使細(xì)菌的耐藥性增強(qiáng)，甚至出現(xiàn)多重耐藥性的現(xiàn)象。因此，不能忽視對(duì)該菌耐藥性進(jìn)行跟蹤監(jiān)測(cè)，防治過(guò)度使用藥物造成多重耐藥株的出現(xiàn)。

病原菌的致病性與所攜帶的致病因子密切相關(guān)，但化膿性隱秘桿菌的致病力同時(shí)還會(huì)受到宿主的內(nèi)在因素、與其他病原菌的協(xié)同作用以及各種毒力因子的差異性表達(dá)等多種因素的影響。在日常的飼養(yǎng)中，需要適當(dāng)增加維生素、礦物質(zhì)與氨基酸以提高動(dòng)物的免疫力，同時(shí)對(duì)環(huán)境需經(jīng)常消毒，降低其他病原菌感染的風(fēng)險(xiǎn)。

綜上，本試驗(yàn)從海南坡鹿體內(nèi)成功分離到1株化膿隱秘桿菌，并對(duì)其主要生物學(xué)特性進(jìn)行了分析，這有助于為野生動(dòng)物源化膿隱秘桿菌的防治和深入研究提供參考依據(jù)和材料。

● 基金項(xiàng)目：廣州市野生動(dòng)物研究中心科研專項(xiàng)項(xiàng)目（2024YL007）

● 第一作者簡(jiǎn)介：薩家祺（1988—），男，獸醫(yī)師；主要從事野生動(dòng)物病原檢測(cè)與鑒定等工作。E-mail：790816473@qq.com

● *通信作者：陳興永，E-mail：507987842@qq.com；張馬龍，E-mail：Zml37663214@163.com